科研狗做了一天的实验，本来高高兴兴。

实验试剂，复核，完美！

实验步骤，复核，完美！

实验仪器，复核，也完美！

但~~

难道，这就是传说中的水逆！？

科研狗都知道水逆是个玄学，但有时候水逆宝宝表示

那么到底是哪里出了问题呢？其实有时候我们在取样和样本保存的时候，一些细节问题没注意到，那么就会导致整个实验所有的努力白费。特别是一些刚进实验室的熊孩子们，一顿操作猛如虎，一看结果全是哭！

好了，好了，小拓今天就来整理一下，一些常规实验样本保存方法及注意事项，包括：分子实验、蛋白实验、病理实验、透射电镜、生化检测。

一、分子实验（RNA/DNA）

RNA提取（QPCR/测序等）

1.组织样本

组织取材在组织离体 30min 内完成，取样的动作要尽量快速利索，将组织切成任一方向小于 0.5 cm 的薄片（尽可能剪碎），抽取 1ml trizol 溶液于 2ml冻存管内，将样本完全浸没于trizol溶液(如0.4g样本需要约2.0 mLtrizol的溶液)。

液氮速冻后，-80 度保存。

注意：为完全有效的保护组织样本，该组织样本应完全浸没入 trizol 溶液中并且组织样本的任何一边的最大厚度不应超过 0.5 cm。

2.细胞样本

细胞收集后用PBS缓冲液快速洗一次，每5×10⁶个细胞加入1 ml trizol，用枪头反复抽打，直至看不见成团的细胞块，整个溶液呈清亮而不粘稠的状态；液氮速冻，-80 ℃保存。

3.血液样本

1）加入1 ml TRIzol和 200-300μL新鲜血液（TRIzol：血液 = 3：1-5：1），用移液器吹打几次以帮助裂解样品中的细胞；

2）样品剧烈震荡混匀1~2 min，直到絮状物全部溶解；

3）室温孵育5 min以使核蛋白体完全分解；

4）写好编号，封口膜封存，-80 ℃冻存。

注意：冰冻血液溶解过程中会有破碎的细胞释放RNA酶，因此建议在冰冻前加入TRIzol，切勿直接冻存新鲜血液，保存好的血液应避免反复冻融。

运输条件：干冰运输

DNA提取

（1）组织样本：取材后，PBS清洗2-3次，液氮速冻， -80 ℃保存

（2）细胞样本：细胞收集沉淀后，液氮速冻， -80 ℃保存

运输条件：冰袋运输

二、蛋白实验（WB/ELISA）

组织样本：取新鲜组织，用无尘纸快速吸去血液，将组织剪成小块，放入装有液氮的锡箔纸中速冻后，放入液氮预冷的离心管中，液氮速冻5min后，-80度保存。

细胞样本：收集细胞悬浮液于1.5ml的离心管中，离心去上清，PBS洗涤三次，液氮速冻5min后，-80 ℃保存。

血清样品：收集全血，室温放置2h，4℃ 3000rpm/min 离心10min，吸取上部的血清即可，-80度保存。

运输条件：干冰运输

全血：新鲜抗凝血，避免剧烈震荡，避免凝血；立即提取。

三、病理实验

1.    石蜡切片

组织样本：取材后，PBS 清洗 2-3 次，使用 4%多聚甲醛固定，组织样本需完全浸泡在固定液中，固定液的容量应足够，一般固定液与组织块的体积比率应大于 10:1。室温保存。

注意：取材样本要新鲜，否则细胞内溶酶体会破裂，造成细胞自融。

细胞样本：细胞爬片后，4%多聚甲醛固定30min，换PBS浸没4度保存。

运输条件：常温运输

其他组织保存、固定等

2.    冰冻切片

取新鲜组织，PBS清洗2-3次后，立即用OCT包埋，-80度固定/保存。或者新鲜组织，PBS清洗后，-80度保存。

运输条件：干冰运输

其他染色保存、固定等
 

3.透射电镜样本

3.1动物组织样本

① 1-3min内取样，取样组织2mmX2mm大小，尽量薄。如来不及修整组织大小可先于电镜固定液内固定半小时左右待组织变硬以后再修整组织进行后固定。超出此范围后组织会无法完全固定，后续实验无法完成，务必请重视此过程。

② 取材时尽量精确到需要观察的目的部位（如观察肾小球取肾皮质；观察胰岛取胰岛丰富的胰尾；皮肤，肠胃等在固定液中易打卷的组织可将组织粘在滤纸上进行固定）。

③ 取材时一定注意避免镊子挤压等机械损伤，刀片要锋利避免挫伤组织。

④ 组织取下后立即投入电镜固定液内室温固定2h，再转移至4℃保存，4℃冰袋运输，在保存和运输过程中固定液切勿冷冻结冰。4℃时样本可保存1个月左右。

3.2细胞样本

贴壁细胞：实验目的重点观察细胞连接，将培养好的细胞弃培养基不经漂洗迅速加电镜固定液用细胞刮沿一个方向轻轻刮下细胞收集到离心管内（避免刮破细胞）。实验目的重点观察细胞器，对细胞形态形状无特殊要求，用胰酶消化，离心收集细胞要肉眼可见细胞沉淀芝麻至绿豆大小，弃固定液后加新的电镜固定液室温固定2h，再转移至4℃保存，4℃冰袋运输，在保存和运输过程中固定液切勿冷冻结冰。

悬浮细胞：离心收集细胞要肉眼可见细胞沉淀芝麻至绿豆大小，弃培养基后加电镜固定液室温固定2h，再转移至4℃保存，4℃冰袋运输，在保存和运输过程中固定液切勿冷冻结冰。

四、生化实验

组织样本：取新鲜组织，用PBS清洗去血液，将组织剪成小块，放入冻存管中，液氮速冻5min后， -80℃保存

血清样本：全血标本室温放置2小时3000rpm/min离心15min，-80℃保存。

血浆样本:可用EDTA或肝素作为抗凝剂，标本采集后30分钟内于2-8℃3000rpm/min离心15min， -80℃保存。

细胞样本:收集细胞沉淀， -80℃保存

运输条件：干冰运输

小提示：

1.血清与血浆的区别

注意：血清血浆颜色外观无差别，不备注清楚无法肉眼分辨。

血清：全血中不加抗凝剂或加促凝剂，血液凝固后取出的不含凝血因子的淡黄色透明液体。

血浆：全血中加抗凝剂，血液凝固后取出的含凝血因子的淡黄色透明液体。

区别1：取血清不加抗凝剂；取血浆加抗凝剂。

区别2：血清中不含凝血因子；血浆中含凝血因子

2.实验用血清还是血浆

生化：建议优先选择血清，其次选择肝素抗凝血浆

ELISA：建议优先选择血清，其次选择肝素或EDTA抗凝血浆

凝血实验：只能选择枸橼酸钠抗凝血浆

血常规：只能选择EDTA抗凝全血

3. 不同抗凝剂对实验检测的影响

注意：有以下检测指标且需要用血浆的，请选择相应的抗凝剂

生化：EDTA对无机离子、碱性磷酸酶、肌酸激酶、超氧化物歧化酶检测有影响；常规生化检测可用肝素锂抗凝血浆。

ELISA：常规指标血清或EDTA及肝素抗凝血浆都可测，凝血相关指标需用枸橼酸钠抗凝，以具体指标为准。

凝血四项：肝素及EDTA可能导致测不出来，只能用3.2%或3.8%枸橼酸钠抗凝：全血=1:9比例抗凝。

血常规：肝素影响白细胞计数，其他抗凝或多或少影响血细胞形态，EDTA为最佳抗凝剂，最佳浓度比为1.5mgEDTA：1ml全血