冰冻切片的一些注意事项

Time:2024-04-16
冰冻切片是利用在低温条件下使组织快速冷冻到一定的硬度,然后进行切片的一种方法,制作过程较石蜡切片快捷、简便,因而多应用于手术中的快速病理诊断。

一、取材

动物麻醉后,解剖迅速取出所需的新鲜组织,立刻转到固定液中固定,此步应尽可能快速完成,防止组织暴露在外因此后续检测结果。

二、脱水

固定好的组织,转到15%蔗糖中脱水至沉底,再转到30%蔗糖中沉底即可。注意:所用的固定液和脱水剂均是用PBS缓冲液来配制,如果不是,会破坏细胞膜的结构。

三、速冻

1、将组织块平放于冰冻切片塑料模具内,缓缓加入包埋剂OCT到模具内,避免引起气泡。注意:需要切片的位置放到模具底部。

另外值得注意的是:一般在进行速冻之前,先用包埋剂浸没组织1-2h,然后再进行速冻。

2、用夹子夹住包埋好的组织放到液氮中,此时开始气化沸腾。注意:包埋模具切勿浸入液氮中,大约10-20s组织即迅速冰结成块。

注:要防止冰晶的产生,就是要控制组织的速冻过程,水的物理性质可知,水在-4度的时候,体积最大,这就说明了,如果水在-4度的停留时间越长,组织体内的冰晶体积就越大,数量就越多。因此,我们要做好冰冻切片,防止组织出现空泡,就是要在速冻过程中,减少水停留在-4的的时间。

3、制成冻块后,即可置入恒冷冻切片机进行切片。备注:若需要保存,应快速以铝箔或塑料薄膜封包,立即置入-80冰箱贮存备用。

4、托台上涂一层OCT包埋胶,将速冻好的组织置于涂好OCT的托台上,放上铁压台,利用重力压平组织。

四、切片

1、把冷冻好的组织承载器装到仪器的进退键上,手工旋转旋钮,观察是否固定好。

2、调好切片厚度,修片,修到需要的位置再切,恒温冰冻切片机为较理想的冰冻切片机,切片机置于低温密闭室内,切片时不受外界温度和环境影响,可连续切薄片至5-20μm,一般切10um既可。

3、切片时,低温室内温度以-15 ~ -22为宜,温度过低组织易破碎,抗卷板的位置及角度要适当,载玻片附贴组织切片,切勿上下移动。

注意:包埋剂的选择,包埋剂是对冰冻切片的质粒是一个重要的影响因素,常规的包埋剂有OCT剂,B超耦合剂和普通的胶水;其中B超耦合剂适用于细胞丰富质地较嫩的组织,普通胶水和OCT剂适用于纤维丰富质地偏硬的组织。

五、冰冻切片的注意事项
       (1) 
速冻:是冰冻切片的关键,因为只有速冻才能减少组织内的冰晶,最好的办法是将速冻头压在组织上,冻好后就可切片。特别适用于较脆的组织。而含有脂肪较多的组织,最放放在液氮里处理。在液氮里冷冻要注意不要冻过头,23秒钟就要拿出来看一下,只要有4/5的组织已经冻住就可以了,待冷冻头拿出后刚好全部冻住,否则就会引起组织发脆,或冷冻头与组织分离 [医学教育网整理发布]
        (2)
固定:切片后应立即放入甲醇中固定,不能等切片干后再固定,后者容易造成细胞退变。一般来说甲醇作用快,收缩小,染色较清晰,是冰冻切片最理想的固定液。

注意此步是针对新鲜组织冰冻切片的固定方法。
       (3)
包埋剂:一般用OCT包埋剂即可,也可用普通胶水代替,但要加入适量的水(胶水与水的比例大约在21左右)。太稀容易损伤切片刀;太稠会粘在切片上不容易洗掉,影响切片的质量。
        (4)
冰冻用切片刀每次要用新的刀片,刀片的质量是影响冰冻切片的关键。

        (5)如果组织发脆,一般是冷冻过久则可等几分钟后再切,也可用手在组织上稍稍加温。
       (6)
冷冻室的温度冬天一般设在-19左右,夏天设在-22左右。不同的组织,有不同的温度要求:肝脏、甲状腺组织温度控制在-15左右,脂肪组织一般在-35以下。
       (7) 
冷冻切片机应长期处于恒温冷冻状态,经常的开关机器电源容易造成压缩机损伤。

表1 石蜡切片与冰冻切片的优缺点比较


不同温度下各新鲜组织冷冻头和冷冻箱的温度

一般方法做的冰冻切片有如下的空泡(冰晶形成的结果)

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结果展示