造模难度系数高的脑胶质瘤模型,你不来学习吗?

Time:2024-04-16
为研究脑胶质瘤的发病机制,必须建立一种稳定、良好的脑胶质瘤动物模型。

脑胶质瘤呈浸润性生长,边界不清,恶性程度高,手术不能完全切除,且由于血脑屏障的存在导致化疗效果不佳,同时对放疗不敏感,故患者多数预后较差,5年生存率不超过5%,术后复发率较高,患者平均生存时间仅一年左右。为研究脑胶质瘤的发病机制,必须建立一种稳定、良好的脑胶质瘤动物模型。

目前建立脑胶质瘤动物模型的方法主要有诱发型、移植型和转基因型三类:(1)诱发型:包括化学物质诱发和病毒诱发,此类动物模型的生物学特征不稳定,且针对某些特殊病毒性肿瘤会表现出很强的免疫原性,故实际应用存在局限性;(2)转基因型:此类动物模型的生物学特征不稳定,来源有限,且实验成本高;(3) 移植型:移植瘤株存活性高且易于保存,动物模型易建立,生物学特性与人脑胶质瘤最为接近,实验成本低廉,是目前建立最多、研究最广泛的胶质瘤模型。

 

一、移植型脑胶质瘤模型

建立移植型的脑胶质瘤模型通常选用C6脑胶质瘤细胞,该细胞:(1)同时具备胶质瘤细胞和恶性细胞生物特性;(2)组织相容性强,与各种大鼠均能配适;(3)在大鼠脑内接种后肿瘤形成时间短,成活率较高,生存期较稳定; (4)生物学特性与人脑胶质瘤较为接近,有浸润性生长、新生血管形成的特性,建立模型的瘤体特征及生长方式更接近于人脑恶性胶质,呈现多形性、高有丝分裂指数、瘤内局灶坏死出血、脑实质浸润、肿瘤血管丰富且无包膜的特点,适合用来研究脑胶质瘤的发病机制和治疗方法。


细胞培养:

取C6脑胶质瘤细胞2×10个,置于DMEM高糖培养基(含10% FBS、100 U /mL青霉素和100 μg /mL链霉素)进行传代连续培养。培养48 h,细胞融合80%-90%时,加入0.25%胰蛋白酶消化。倒置显微镜下观察到细胞回缩变圆,且有个别细胞脱落时加入完全培养基终止消化。台盼蓝排斥试验检测细胞活力,C6存活率应>90%

注意:若细胞活性差,则需再次培养,直至检测活性符合造模需要为止。1000 r /min离心3-4 min,收集细胞,用无血清培养液吹打成单细胞悬液,采用血球计数板计数,将单细胞悬液密度调整为1 × 10个/10 μL,置于37 ℃恒温振荡水浴中存放待用(目的:避免由于细胞死亡和沉底造成细胞密度不均匀),尽量在短时间内(注意:不超过90 min) 接种。

 

二、脑胶质瘤模型造模方法

动物品系:SPF级SD大鼠,健康,6~8W,雄性,体重为180g-200g;

实验分组:正常对照组、模型组;

实验周期:4-6 weeks

实验应用:用于研究脑胶质瘤引起的脑部损伤;

 

造模方法 

(1)大鼠称重后以1.25%阿佛丁(三溴乙醇)按10ml/kg体重腹腔麻醉,麻醉成功后剃除颅顶部毛发,取俯卧位,将动物头部固定于脑立体定位仪上,保持颅顶水平位置;

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图注:拓普生物脑立体定位仪

 

(2)手术区常规消毒,沿颅顶正中矢状线纵向切开长约2cm皮肤,分离暴露颅骨;

(3)钝性分离肌肉及骨膜,双氧水消毒及止血,在距前囱正中线前6mm、中线旁开2~3cm处,用5mL注射器针头钻孔,不可伤及硬脑膜;

(4-1)30 μL微量注射器抽吸25μL单细胞悬液,针尖调节至触及硬脑膜,沿骨孔缓慢垂直进针至硬脑膜下5.5 mm,退针1 mm后固定(目的:创建一个细胞悬液暂时存储空间,并防止其沿针道扩散);

(4-2)缓慢将细胞悬液注入尾状核内(注意:如果太快会引起细胞悬浮液从脑内溢出,沿脑脊液播散,导致种植细胞数减少,肿瘤难以成长为实体瘤,或细胞在头皮下生长,造模失败),注射时间为10 min(1 μL /min),注射完毕后留针5 -10min(目的:留针可防止肿瘤细胞溢出,有利于瘤细胞沉积在穿刺道的底部,减少因虹吸效应导致细胞沿注射针回流出脑外,并延长肿瘤细胞与靶点脑组织的接触时间,从而提高成瘤率;同时有利于脑组织适应局部的压力增高,减少瘤细胞沿针道种植转移),缓慢拔针(目的:防止接种细胞的反流),骨孔用骨蜡密封住;

(5)逐层缝合皮肤,生理盐水冲洗术野,喷洒适量抗生素,缝合皮肤,切口消毒,放入保暖箱内。大鼠麻醉苏醒后放回饲养箱饲养并观察。

 

三、术后检测

1、一般情况:

(1)正常组生长状况良好,活动、饮食均正常;

(2)模型组接种后随着时间延长,前期大鼠进食逐渐减少,体重逐渐下降,眼周有出血症状,中期甚或出现眼周瘀血,精神逐渐萎靡、反应迟钝、腹泻,后期上述症状明显加重,皮毛失去光泽,部分出现偏瘫、昏迷,甚至死亡。

 

2、全脑标本观察:

可在肿瘤细胞种植后至实验结束前分时间点获取全脑标本,以测量胶质瘤大体标本的体积,按脑表面的接种穿刺点作一冠状交叉切口,观察肿瘤生长情况并计算肿瘤体积= a×b×c(a为肿瘤的最大径,b为与最大径垂直的最宽径,c为肿瘤的高) ;

模型组大脑左侧肿瘤浸润性生长,较周围正常组织颜色深,脑中线向右偏,占位效应明显,切面可见肿瘤内出血和组织坏死。随着建模时间的延长,肿瘤的体积会不断增加。

 

 图注:正常组脑中线居中(左)与模型组占位引起脑中线偏移(右)



3、HE染色(苏木精-伊红染色):

模型组脑组织HE染色后可见肿瘤细胞呈椭圆形,核大深染,核分裂相多见,围绕血管生长活跃,排列紊乱,肿瘤组织内有出血和坏死区域,伴有丰富的膨胀的微血管,微血管内充斥着大量的红细胞,并被坏死区域包围。

图注:C6脑胶质瘤倾向围绕血管生长

 图注:C6脑胶质瘤接种后7天、14天、21

 

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