细胞瞬时/稳定转染

栏目:细胞瞬时/稳定转染 发布时间:2024-04-16
细胞转染的基本原理是将外源的DNA克隆到载体上后导入细胞,借助宿主细胞表达载体上的目的片段,从而使目的基因在细胞中发挥功能。目前转染方法有多种,如脂质体转染法、磷酸钙-DNA共沉淀法、电穿孔转染法、腺病毒感染等。

细胞转染的基本原理是将外源的DNA克隆到载体上后导入细胞,借助宿主细胞表达载体上的目的片段,从而使目的基因在细胞中发挥功能。目前转染方法有多种,如脂质体转染法、磷酸钙-DNA共沉淀法、电穿孔转染法、腺病毒感染等。

常规转染技术可分为两大类,一类是瞬时转染,另一类是稳定转染。瞬时转染的外源DNA不整合到宿主的染色体中,通常表达只持续几天,一般在转染24-72小时后检测。稳定转染的外源DNA将整合到宿主染色体中,可持续性表达,一般用于稳定细胞株的构建。

服务内容

脂质体转染(瞬转)

1.载体构建(可选),RNAi合成(视转染情况而定);

2.将细胞按照1~3x105接种到6孔板中,加入2~4mL的完全培养基,混匀放置在二氧化碳培养中,37过夜;

3.无菌状态下配置如下液体:

  a.100μLOpti-MEM培养基稀释2μg的待转染质粒;

  b.100μLOpti-MEM培养基稀释25μLLipofectamine转染试剂;

4.a, b液混合并混匀,室温放置15min

5.细胞培养至80%单层左右,用Opti-MEM培养基洗涤细胞两次,每孔加入1mL Opti-MEM培养基,并将混合后的ab溶液逐滴加入到每孔中,按十字方向轻摇混匀,二氧化碳培养箱中培养;

6. 4-6小时后将转染液吸出,换为新的完全培养基继续培养,培养3-4天后检测蛋白表达量。

腺病毒转染(瞬转)

1.腺病毒质粒构建;

2.以脂质体转染的方法包装腺病毒,测其滴度;

3.不同MOI下测试得最佳转染效率值;

4.使用最佳MOI对细胞进行转染。

慢病毒转染(稳转)

1.慢病毒质粒构建;

2.以脂质体转染的方法包装慢病毒,测其滴度;

3.不同MOI下测试得最佳转染效率值;

4.使用最佳MOI对细胞进行转染;

5.进行稳转株筛选。