怎样做出锐利的Western Blot 条带

 在电场的作用下将电泳分离的多肽从聚丙烯酰胺凝胶转移至一种固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测，经常用于目的蛋白的表达特性分析、组织定位、表达量分析及与其他蛋白的互作。依其原理，可分为两种方法：A、直接法和B、间接法。

两种方法比较：

好的蛋白是做出符合要求的目的条带的前提：

经验：我们通常使用BCA法来定量蛋白，提取蛋白质过程中，应在低温环境下进行，以抑制蛋白酶的水解作用，可加入适合的蛋白酶抑制剂。当提取磷酸化的蛋白时一定要加入磷酸化的蛋白酶抑制剂（磷酸化的蛋白极易降解）。蛋白样品建议分装后冷冻干燥或直接以液体态置-80℃中保存，不要反复冻融。

经验：上样时根据蛋白表达丰度调整蛋白上样量，尽量保证每孔上样量保持一致。胶最好现配现用，如果需要保存，最好用湿润的保鲜膜包好并置于4℃冰箱中。

经验：胶在负极，膜靠近正极；滤纸不要大过膜，防止短路；夹好膜和凝胶后，确定在凝胶、膜和滤纸之间没有气泡存在，否则会导致转膜不完全；注意一定要戴手套或塑料镊子接触膜，避免手上的蛋白和油脂降低转膜效率。转膜过程中，尤其是高电流快速转膜时，通常 会有非常严重的发热现象，最好把转膜槽放置在冰浴中进行转膜。对于湿转法：一般转膜的电流在200mA，转膜时间为120分钟。具体的转膜时间要根据目的蛋白的大小而定，目的蛋白的分子量越大，需要的转膜时间越长，目的蛋白的分子量越小，需要的转膜时间越短。

经验：常见的封闭液有5%脱脂奶粉、BSA和Western Blot膜封闭液（生物试剂公司提供）。但是封闭液的选取具体得看抗体说明书，有的抗体是明确要求只能用BSA，而封闭液浓度的选择也是具体得看抗体的要求，但是一般情况5%BSA会比5%牛奶的效果好。选择抗体时，一方面需要考虑所选抗体是否能识别凝胶电泳后转印至膜上的变性蛋白，另一方面需要考虑所选抗体是否会引起交叉反应条带。

1.出现空白条带

原因：出现空白条带的原因比较多，如一抗浓度过低，二抗种属加错（兔抗加成鼠抗），转膜时间过长、过短都会出现空白条带。

解决方法：仔细检查抗体是否加错，确认转膜时间没有问题。

经验：如果条带上没有一点信号，大部分情况是抗体加错了。如果出现细微条带，可能是因为上样量太少，蛋白量太低。或是一抗浓度低，发光液失效。当然如果转膜时膜放反了的话那肯定是不会出现条带。所以实验时一定要细致认真。

2.高背景

原因：封闭不够好，一抗浓度过高，洗膜时间和次数不够。

解决方法：降低一抗浓度，增加洗膜时间和次数。

经验：高倍镜可能是WB中最长出现的问题，目的条带单一清晰，但是其他地方有弥漫性较为均一的背景。洗膜时间按照5min*5次或者10min*3次。如果洗膜时间没有偷工减料的话，调整一抗浓度就会得到干净清晰的条带了。

3.非特异性条带

原因：一抗非特异性与蛋白结合，一抗浓度过高。

解决办法：更换一抗。

经验：这种情况绝大多数原因是因为一抗不好。出现这种情况就无法判断你需要的目的条带是哪一条。如果没有条件更换更好的抗体建议试用阴性对照和阳性对照来判定那一条是你需要的目的条带。还有很小可能是因为一抗浓度过高引起的非特异性结合。

4.条带中出现白圈

原因：转膜时膜和胶之前存在气泡。

解决办法：转膜前赶除膜与胶之间的气泡。

经验：我们常常将电转液倒入一个盘子里，倒入的液体不能太多也不能太少，最好的高度是与放上第一层滤纸齐平，然后往滤纸上浇点转膜液，把电泳胶用清水清洗下，将电泳胶平铺到滤纸上，仔细检查滤纸与胶之间是否有气泡，可以左右前后观察，不同方向观察之后确认无气泡，然后再往胶上面浇点电转液，用两只手的拇指和食指轻轻夹住PVDF膜的两侧中间，使膜成U型，然后将U型的底部接触胶的中间，慢慢往两边放下膜，这样一般气泡很少。然后上层滤纸同样用U型的放置方法，用切胶板压住一边另一块切胶板从内向外赶气泡，然后盖上海绵。注意不要来回赶气泡，这样反而会带入气泡。

5.某个条带变形

原因：SDSPAGE胶中存在气泡或者某不溶性颗粒。 

解决办法：配胶过程中要小心，使用无杂质的液体。

经验：很多实验室中使用的不是最新的设备，比如配胶用的海绵垫，如果用了很多年之后，会从下面往上面漏小气泡，当气泡足够小并且胶快凝固的时候，走到中间的小气泡就停留在胶内，并会影响到后面的跑胶。另外配胶用的水，SDS，Tris缓冲液要注意不要有杂质。

6.最边缘条带弯曲

原因：电泳电流不均一。

解决办法：换用新的电泳槽； 不使用两边的两孔。 

经验：一般我们使用的是10孔的的胶，如果你上样刚好10个孔，那么最两头的两个孔肯定会歪曲。另外上样最好在胶的中间，这样电场均一。

7.其他问题

（1）整个条带呈 “ ︶ ” 状：凝胶冷却不均一，电泳槽老化；

（2）整个条带呈“ ︵ ”： 凝胶左右两头没有凝固好；

（3）溴酚蓝拖尾：样品溶解不好；

（4）纵向的纹理：上样样品中存在不溶性颗粒；

（5）溴酚蓝很粗：浓缩胶浓缩效果不好，可能是浓缩胶太短，或者是浓缩胶配错；

（6）在分离胶中跑不动：Tris-Cl PH值不对，或者忘记加SDS。