Wnt/β-actenin信号通路在心血管疾病的研究思路

我（注：这里“我”指本期作者，而不是开放活跃创新的拓拓哈哈）一个这么保守的人，今天决定跟大家分享一个与我有相同气质的高度保守的信号通路，Wnt/β-catenin信号通路。

Wnt得名于Wingless与Int1基因，该通路是细胞间交换信息的重要手段，是胚胎及器官发育的重要信号通路之一，参与调控机体内多种细胞的增殖、分化、极化、迁移及凋亡等过程生物学过程，与肿瘤，干细胞分化，中枢神经系统疾病，心血管急性，骨科疾病等都有密切联系。

在哺乳动物中目前已经发现了19个Wnt蛋白，Wnt蛋白是棕榈酰化修饰的脂溶性蛋白，一般认为他是作为外泌体，或者跟低密度脂蛋白结合后转运到邻近的组织发挥作用。近年也有些研究认为Wnt被一个Dally样蛋白结合而水溶性增加，从而在细胞间运行。

Wnt信号通路分为经典通路和非经典通路：

经典通路：即今天要介绍的Wnt/β-actenin信号通路，最终依赖于β-actenin的核异位，大多数Wnt的蛋白都激活该通路。

非经典通路：包括Wnt/PCP通路（由Wnt11蛋白激活），以及Wnt/Ca2+通路（由蛋白Wnt5激活）。

我们从整体来看看来自KEGG的信号通路图，可以发现这条通路上有很多抑制因子。之前提到过，Wnt通路与我们的胚胎和器官发育有关，可以想象，需要对这条通路严加看管，因为它的失活或者过度表达都可能会导致灾难性的后果。

下面我们大概了解下Wnt/β-actenin信号通路：

数据来源：DOI: 10.1016/j.cell.2017.05.016

在Wnt信号通路关闭的情况下，Axin、APC和GSK3β与β-catenin形成破坏复合物，β-catenin被泛素化修饰而降解。当Wnt蛋白与卷曲蛋白FZD结合后，激活Dvl蛋白，抑制 axin、GSK- 3、与 APC 蛋白，β-catenin不被降解而在胞浆内累积，并进入细胞核内，与TCF/LEF 转录因子结合，促进特定基因的转录。除此之外，APC基因突变也会导致β-catenin不被降解而积累从而核异位，APC突变在大多数结直肠癌中发生，APC-min小鼠就是对APC基因进行敲除而构建的肠道肿瘤模型小鼠。

Wnt 信号通路在心脏发育、血管生成和心脏肥大中起关键作用，在心肌损伤中，可以增加内皮细胞和心外膜细胞的增殖，促进心肌纤维化和心脏重构。下面我们通过一篇1区19.6分文章《Wnt/β catenin signaling mediates both heart and kidney injury in type 2 cardiorenal syndrome》，了解一下Wnt信号通路在心血管疾病中的研究方法。

文章首先用主动脉缩窄术（TAC）构建小鼠心肌肥厚模型，通过WB检测和HE、Masson染色对模型进行评价，从结果上来看TAC引起以心脏肥大、炎症和纤维化为特征的实质性心脏病变。肾脏方面，TAC引起PC蛋白表达减少，肾组织纤维黏连蛋白升高，Masson染色显示肾间质纤维化，表明肾脏损伤。

造模成功后，先用qRT-PCR检测心脏组织中19个Wnt基因，再用WB验证阳性基因中较重要的Wnt1，Wnt3a蛋白表达以及总β-catenin和活化β-catenin的表达，这里注意活化β-catenin的是非磷酸化的，选择抗体的时候有标明是Active。跟对照组相比，TAC组的上述Wnt信号通路蛋白都有表达的上调。

下一步，在TAC术后4周加入β-catenin抑制剂ICG-001和氯沙坦进行干预，观察是否对疾病的发展有影响。结果表明，加入抑制剂后，心脏肥大、炎症和纤维化指标均有改善。

氯沙坦可有效改善TAC介导的心脏损伤，血管紧张素-肾素系统（RAS）是否可在体内调节Wnt/β-catenin信号通路？

因此作者通过体外实验和体内实验验证其假设：

体外实验中，于原代心肌细胞和心肌成纤维细胞加入Wnt 3a诱导β-catenin，RAS成分表达增加。加入β-catenin抑制剂后也抑制了RAS成分的表达。

体内实验中，TAC诱导ACE、Renin和AT1在心脏中的表达；而ICG-001或氯沙坦治疗降低了这些RAS成分的表达，通过WB和病理检测结果发现，也改善了TAC诱导的肾小球损伤和纤维化反应。

接下来，作者陷入思考，Wnt/β-catenin信号通路，RAS，心脏，肾脏，他们是通过什么机制串扰？在几种可能的途径中，血液循环是连接两个器官最可能途径。因此，作者用对照与TAC模型组小鼠的血清，处理HKC-8细胞，结果发现TAC组的小鼠血清可以活化β-catenin和增加 Snail1 and Kim-1的蛋白表达，而加入ICG-001或氯沙坦后抑制了这一作用。

为了进一步证实TAC血清激活通过β-catenin介导的肾损伤，我们用对照组与TAC模型组小鼠的血清处理β-catenin敲低的HKC-8细胞，结果显示，敲低β-catenin降低了fibronectin, Kim-1, Snail1以及RAS蛋白成分的表达。

作者通过对小鼠血清的检测，选定炎症因子TNF-α进行验证。通过免疫荧光对β-catenin进行染色，发现TNF-α引起β-catenin在HKC-8细胞核内积聚，而TNF-α处理细胞的同时加入ICG-001或氯沙坦，β-catenin的核内积聚被阻断。通过WB分析，TNF-α同样上调了Snail1和 Kim-1的表达，且ICG-001或氯沙坦抑制TNF-α的这一作用。以上数据表明，TAC模型血清TNF-α含量升高，TNF-α引起Wnt/β-catenin信号通路的激活，并引起肾脏细胞的损伤。

接下来，作者又发现，肾脏一个抗衰老蛋白klotho，在TAC模型小鼠的血清或肾脏中表达被抑制，而TAC模型的ICG-001或氯沙坦治疗组，Klotho恢复了其表达。最后为了探寻可能的机制，通过上述提到过的类似方法，在原代心肌细胞和心肌成纤维细胞进行体外实验，表明Klotho蛋白的缺失会增强Wnt/β-catenin信号通路的表达，增加了心肌细胞的肥大和纤维化程度。

到此，故事讲完了。

我的体会是，现在对于疾病及其相关机制的研究，不仅仅满足于某一脏器，某一机制，更多的是疾病的脏器间是否有串扰，机制方面也可以研究不同通路的联合，如Wnt/β-catenin和Hippo/YAP，Wnt/β-catenin和Notch，在很多方面都相互影响，又或者某信号通路与研究热点进行联合分析，如Wnt信号通路与m6A甲基化修饰，Wnt信号通路和铁死亡等。