歪打正着：肝脏异位表达LPL基因矫正GPIHBP1缺陷导致的严重高甘油三酯血症是这样发现的

编者按：本栏目为灵赋拓普生物《科研无止境·我与实验动物那些事儿》入选作品展示系列，分享来自各个科研单位、医院高校、实验动物中心等科研老师们的优秀作品。科研是一场无止境的探索，欢迎各位老师投稿，分享自己在日常科研中的感想，我们期待与更多的动物科研同行携手并进，创造生命科学领域更美好的明天。
袁晨晨
（扬州大学附属医院消化内科胰腺中心）
无知无畏，歪打正着
在新冠肆虐的2020年春季，我的导师南京大学的李维勤教授把肝脏表达脂蛋白脂酶（LPL）基因实验性治疗LPL基因缺陷引发严重高甘油三酯血症的课题交给了我。由于种种原因，大半年过去了，一只LPL基因缺陷的小鼠都没有繁殖出来，合作单位-五加和基因公司给我们提供的腺相关病毒（AAV）-LPL在我手中毫无用处。眼看着毕业日期一天天逼近，我陷入了焦虑、怀疑和自我否定的负面情绪中。虽然导师及时发现并开导我，但实验不能启动我怎样才能毕业呢？
因为我们实验室主要研究高甘油三酯引起的急性胰腺炎，除了LPL基因缺陷的小鼠会发生高甘油三酯血症，我们还有一种GPIHBP1（GPI，糖基化磷脂酰肌醇锚定高密度脂蛋白结合蛋白1）基因敲除的小鼠，这种小鼠很容易繁殖。GPI是一种结合LPL的蛋白，分布在血管内皮上。如果没有GPI，LPL就不能水解血浆甘油三酯，因此也会引发高甘油三酯血症，但在离乳后才发生。夜不能寐中，我突发奇想，反正都是高甘油三酯，把AAV-LPL给GPI缺陷的小鼠静脉注射后肝脏去表达，说不定也能降低甘油三酯呢。我叫醒了室友，告诉他我的想法。他即使在半睡半醒中，一句话就甩过来了，A基因缺陷用B基因来治，脑子进水了吗？我接着查了几篇基因治疗的文章，的确都是A基因缺陷用A基因来治，B基因缺陷用B基因来治。我本来还想去找导师商量的，这样一来我就只能扪在心里了。但是这个想法一旦形成就反复地折磨着我。正好那几天有一批GPI敲除的小鼠要淘汰，我就拿了几只，把AAV-LPL从尾静脉中注射了进去。一个星期后，从小鼠的眶静脉取血离心后一看，没有打AAV-LPL小鼠的血浆依然像牛奶一样，是乳白色的。而那几只打了AAV-LPL小鼠的血浆居然清亮的像啤酒一样，其中的甘油三酯竟然降低到了正常小鼠的水平。

我沉住气又等了一周继续取血检查，仍然是同样结果，于是我告诉了导师。他也同样难以置信，说GPI的基因缺陷怎么能用LPL来矫正呢？于是我们和合作单位开了一个线上会议。北大医学部的刘国庆教授是研究LPL的专家，看到结果后也同样很震惊。讨论后先让我用一批GPI敲除的小鼠给以不同的AAV-LPL剂量，重复一次实验。同时我们查阅文献、咨询其它专家，届时再来分析这种结果的原因。

深入分析，探索原因
重复实验的结果表明，AAV-LPL可以剂量依赖性地矫正GPI缺陷小鼠的严重高甘油三酯血症。GPI基因缺陷的小鼠LPL的生成是正常的，但是不能被GPI结合转运到毛细血管的内皮细胞血管面上，并锚定在那里水解血浆中的甘油三酯，因此GPI缺陷的小鼠和病人都发生高甘油三酯血症。但是GPI缺陷和LPL缺陷小鼠有一个显著不同是LPL缺陷小鼠出生就是高甘油三酯，且两三天之后就死亡了；而GPI缺陷小鼠出生时没有明显高甘油三酯，直到离乳后才发生高甘油三酯。鉴于血浆甘油三酯都是LPL水解的，这就表明在离乳前即使没有GPI，LPL也能水解血浆甘油三酯。这是为什么呢？LPL不是需要GPI转运到血管内皮表面才能水解甘油三酯吗？难道哺乳期小鼠的LPL就不需要GPI转运吗？这是一个很令人不解的问题。
在第二次线上会议我提出了这个问题。刘老师说他记得在瑞典做博士研究时，他的导师曾经应用原为杂交技术研究过不同物种LPL的时空表达，说小鼠和其它动物不一样，肝脏会在哺乳期表达LPL，但成年后就不表达了，而肌肉和脂肪组织仍然表达。并说GPI小鼠哺乳期没有高甘油三酯很可能与肝脏表达LPL有关，当成年后肝脏不表达LPL了，血浆甘油三酯就不能被水解而发生高甘油三酯血症。
可是问题来了，即使肝脏表达LPL，没有GPI的话LPL同样不能转运到血管内皮表面水解血浆甘油三酯。我的导师是普外科专家，对肝脏的结构很熟悉，他说肝脏中肝血窦的毛细血管内皮和其它组织毛细血管的紧密连接不一样，是疏松连接；内皮下还有狄氏腔隙，这样可以保证血浆中需要代谢的大分子很容易穿过毛细血管和肝细胞直接接触。也就是说，如果肝细胞表达LPL，就有可能不需要转运到毛细血管表面就能和血浆中携带甘油三酯的脂蛋白发生相互作用。
但是还有一个问题，就是即使肝细胞表达的LPL不需要转运到毛细血管内皮就可以分解血浆甘油三酯，那么在没有GPI情况下，LPL是怎样锚定在肝细胞表面水解血浆甘油三酯的呢？
带着这些问题，我先应用定量PCR检测了新生、哺乳期、成年后GPI缺陷小鼠和大鼠的肝脏LPL表达，结果发现的确小鼠的肝脏在新生期、哺乳期LPL基因表达水平比成年期高50多倍，而新生和哺乳期的大鼠肝脏和成年期一样几乎不表达LPL，因此大鼠出生后就发生严重的高甘油三酯血症，而且新生和哺乳期死亡率很高。然后我检测了静脉注射AAV-LPL在各个组织的分布，发现95%以上的外源性LPL都表达在肝脏。接着我们又做了外源性LPL在肝脏的免疫荧光，证实LPL分布在肝细胞的表面而不是血管内皮上。通过查阅文献，发现肝细胞表面有与GPI结构相似的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（HSPG），而且丰度很高。这样我们就做了HSPG和LPL的共定位，证实外源性LPL和肝脏HSPG共同定位在肝细胞表面。我们后来又在GPI缺陷小鼠上补充做了AAV-LPL在肌肉的表达，结果LPL不能到达血管内皮表面，而且对血浆甘油三酯没有影响。

扩大成果，圆满收官
显然，体内没有GPI时，肝细胞表面的HSPG能够替代GPI锚定LPL，而血浆可以通过肝血窦毛细血管的疏松连接，因此血浆甘油三酯能够被肝细胞表面的LPL水解；肌肉和脂肪细胞虽然能产生LPL，并被HSPG锚定在肌肉和脂肪的细胞表面，但不能转运到毛细血管内皮的血管面。而血浆不能通过肌肉和脂肪组织的毛细血管壁，因此血浆中的甘油三酯无法在肌肉和脂肪组织中被水解。这样我歪打正着得到的肝脏表达A基因能矫正B基因缺陷所致高甘油三酯血症的结果，就得到了合理的解释。
回答了科学问题后，我们还将AAV-LPL的肝脏异位表达方法应用于GPI缺陷的成年和新生期大鼠，不仅纠正了大鼠的严重高甘油三酯血症，还减低了新生大鼠的死亡率。我们进一步在接受AAV-LPL和没有接受的GPI缺陷小鼠体内通过给以雨蛙素诱发急性胰腺炎，证明肝脏异位表达LPL能够防止急性胰腺炎的发生，有可能作为一种新的治疗方法应用于GPI基因突变导致严重高甘油三酯血症发生急性胰腺炎的患者。


在导师的指导下，我们总结了这些数据，写成了一篇“AAV-mediated hepatic LPL expression ameliorates severe hypertriglyceridemia and acute pancreatitis in Gpihbp1 deficient mice and rats”论文（AAV介导的肝脏LPL表达治疗GPIHBP1缺陷小鼠和大鼠的严重高甘油三酯血症和急性胰腺炎），投寄到了基因治疗领域的权威期刊Molecular Therapy。两周后我们收到了主编的回复，让我们补充一些关于毒性研究和基因产物代谢数据，并修改一下英语的表达方式，并回答几个有关AAV载体构建的问题。完成了这些工作再投回去，编辑部很快就通知我们文章接受了，于2023年11月在线发表（https://doi.org/10.1016/j.ymthe.2023.11.018.）。当然我也顺利地通过答辩毕业了。不过我心里总觉得有些对不起GPI缺陷的小鼠，是我当时的无知，让它们献身到了LPL肝脏异位表达的基因治疗实验中。