如何获得高质量免疫组化（IHC图像）

由于免疫组化染色过程中存在很多步骤或环节，每一个步骤或环节都可能影响到染色的最终结果，因此，要做好一张高质量的免疫组化切片并不是一件非常容易的事，下面总结了几点小问题，希望能给到帮助。

组织取材要快，不宜过大，太大太厚的组织不利于均匀一致的固定，取材厚度应小于5mm，避免人为损伤。

固定的目的是①防止标本从玻片上脱落；②除去防碍抗原-抗体结合的类脂，使抗原抗体结合物易于获得良好的染色结果；③固定的标本易于保存。组织取材后应即刻固定，常用固定液有中性甲醛、4%多聚甲醛（推荐使用），固定体积10倍于组织，固定时间6-24小时，固定时间不够或过长，都有可能引起抗原丢失。

切片的质量关系着免疫组化染色好坏，保持切出的组织完整、平整，切片皱褶、边缘卷曲会造成之后试剂难以洗净，显色时这些区域着色会增强。

三级二甲苯脱蜡，每次脱蜡15分钟，脱蜡彻底，二甲苯使用次数不宜太多，每100张片子更换一次（每周更换一次也是可以的）。

由于组织中部分抗原在甲醛或多聚甲醛固定过程中，发生了蛋白之间交联及醛基的封闭作用，从而失去抗原性；通过抗原修复，使得细胞内抗原决定族重新暴露，提高抗原检测率。修复方法有酶修复、高压热修复、微波热修复，不同抗原有各自最适的修复方式，对大多数的抗原来说微波热修复都能得到很好的效果。对于修复液大多数使用PH6.0的柠檬酸钠修复液，但大多数的抗体使用EDTA（PH8.0或9.0）修复液效果好于PH6.0的柠檬酸钠修复液

一抗孵育条件在免疫组化反应中最重要，包括孵育时间、温度和抗体浓度。一抗孵育温度有几种： 4 度、室温、37 度，其中 4 度效果最佳；孵育时间：这与温度、抗体浓度有关，一般 37 度 1-2h，4 度过夜（从冰箱拿出后 37 度复温 45min） 。具体条件还要摸索。二抗孵育条件：二抗一般室温或 37 度 30min-1h，具体时间需要摸索......

显色液应现配现用，肉眼或显微镜下观察，当有明显棕色出现，应终止显色，显色时间不宜过长造成背景染色。