助力脊髓损伤再生之桥：比格犬脊髓损伤模型建立与药物验证研究

脊髓损伤（spinal cord injury，SCI）是由高能量创伤引起脊柱骨折或脱位而导致的脊髓神经受损， 是一种致残致死率较高的疾病。由于脊髓损伤后的病理、生理机制复杂，目前治疗效果尚不理想，而要研究脊髓损伤机制及其治疗方法，构建动物脊髓损伤模型至关重要。本文结合灵赋拓普生物大动物技术部丰富的实验经验，分享比格犬脊髓损伤模型建立与药物验证研究。

一、实验材料
（1） 实验动物：比格犬，10-14kg，雌性；

（2） 实验药品：舒泰50，丙泊酚，异氟烷，青霉素，痛立定；

二、实验方案

模型建立与药物干预

比格犬通过肌肉注射舒泰50进行麻醉，行气管插管，术中2%异氟烷进行维持麻醉。动物采用正中俯卧位，固定四肢，对T10为中心的手术区域及周围进行备皮消毒，铺无菌中单，依次切开皮肤，筋膜，及韧带，剥离附着于脊柱的肌肉，充分暴露椎板，然后进行椎板切除，暴露脊髓，造成脊髓压迫，同时保持压迫10min，形成重度脊髓损伤。在局部止血后，缝合肌肉和皮肤。等动物麻醉转醒后单独放入犬笼中。受试组分别在术后D1，D3，D5，D7，进行脊髓给药治疗干预。对照组无需干预治疗。

术后护理

术后每日伤口换药护理持续7d，抗生素5d预防感染，术后48h给予镇痛药。若手术后出现食欲不振，适当予以肠外营养，补充体液和能量。

每日进行大体状况检查，若出现排尿困难，则需要每天进行腹部按摩，促进排尿。必要时进行尿道留置导尿管。若出现便秘，排便困难等情况，则需要饲喂易消化的食物，必要时进行通便。其他临床症状，积极对症治疗。

常规临床体征观察，造模后每日观察其运动状态、后肢有无疼痛放射、有无食欲、精神状态、能否自主排尿、排便等临床体征，并做好记录。

三、模型评估

行为学评估

1) 步态评分标准

手术造模之前及PB-NPs干预之后于第1周，第2周，第3周，第5周，第8周，固定时间进行行为学评分，共计6次步态评分，每次保留原始实验记录，及视频。每次评分时间为10分钟/动物。每次3人独立评分。

2) 本体感觉评价

将犬胸腹托起的同时把前肢或爪的背面轻轻地放在不滑的地面上。假如他们能立即恢 复肢体则视作正常评分为2；将爪复位但能看到一个时间延长期或很困难的做这样被视作反应迟钝评分为1；没有反应的评分为0。 

3) 伤害险知觉评价

浅感觉可以通过刺激脚蹼来评价，深感觉可以通过刺激脚趾来评价。

4) 排尿功能评价

观察排尿情况：若有自主排尿，记录频次、每日尿量；若无自主排尿，则需观察排尿异常类型（尿潴留、尿失禁等），根据人工辅助排尿（手法排尿或导尿）情况记录每日的频次及尿量。此外每日还需观察有无血尿、脓尿等情况并对症处理。

影像学评价

造模前1d和造模后1d、20d、56d，安排MRI检测， T1/T2序列扫描受损部位+泌尿系统（MRU：肾脏、膀胱、输尿管），观察脊髓硬膜内外的结构变化、神经水肿以及泌尿系统形态，术后20天和术后56天观察瘢痕情况。

手术造模之前及手术后1w，2w，3w，5w，8w各一次进行腹部超声检测，测量膀胱大小及残余尿量等；各行一次尿流动力学检查，评价膀胱排尿功能（包括最大膀胱容量、膀胱最大排尿压力、膀胱漏尿点压及膀胱顺应性等）。

1）电信号采集

造模前1d和造模后1d、20d、56d，进行肌电波检测1次，通过保定器固定，对四肢进行电刺激（3mA、5mA、7mA），记录肌电信号，评估造模效果。

2）血液学检查

造模前1d和造模后1d、7d、28d、56d，采集5ml血液（非麻醉状态）进行血生化、血常规检测。每个时间点，每只动物再取2ml无抗凝全血，分离血清，分别用冻存管冻存在液氮用于后期疾病biomarker分析。

3）病理组织切片

同一只动物身上取受损处脊髓，未损伤处脊髓，肾脏+输尿管+膀胱各2份样本，其中一份用福尔马林固定，每份样本各做横切，纵切两片切片，分析同一只动物之间受损与未受损脊髓之间的差异，和分析不同动物组别之间受损脊髓之间差异。评估药物干预对脊髓修复的差异。

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