移植物抗宿主病小鼠模型，是时候了解它了

一、人类临床信息
同种异体造血细胞移植是治疗难以治愈的血液病的常规的、成熟的治疗方法，其最常见的危及生命的并发症是移植物抗宿主病（Graft versus Host Disease, GvHD）。当供体组织（移植物）中的免疫功能正常的T细胞将受体（宿主）识别为外来物质时，就会发生GvHD，其所产生的免疫反应会激活供体T细胞，使其拥有溶解细胞的能力、攻击受体以消除携带外来抗原的细胞。临床上主要有急性GvHD（aGvHD）和慢性GvHD（cGvHD）两种。在所有同种异体造血细胞移植患者中，30%-50%发生aGVHD；在接受同种异体造血干细胞移植(同种异体移植)的非操纵供体移植物，并接受钙调磷酸酶抑制剂和抗代谢物的标准预防的患者中，30%-70%发生cGvHD。典型的aGvHD体征包括皮肤斑丘疹、高胆红素血症伴肝脏胆汁淤积、小胆管损伤导致的黄疸、恶心、呕吐和厌食，以及水样或血性腹泻和痉挛性腹痛（即累及皮肤、肝脏、上下消化道，还有肺脏）；cGvHD不仅累及aGvHD可累及到的脏器，还会影响其他多个脏器或系统，如：口腔、食管、骨骼与肌肉、关节、筋膜、眼睛、淋巴造血系统、头发与指/趾甲、生殖系统等。常见皮肤、黏膜、软组织的硬化、纤维化，高眼压、肺脏纤维化^{[1, 2]}。

为了深入了解疾病机制、预后及生物标志物的开发，cGvHD小鼠模型作为临床前实验工具发挥了重大的作用。目前cGvHD小鼠模型主要有2种：①同种异体小鼠模型，主要用于研究cGvHD进展机制和治疗方法；②人源化小鼠模型，更利于临床转化。

1. 同种异体小鼠模型

通常使用具有不同的主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex, MHC）的2种小鼠，分别作为供体和受体，最常见使用C57BL/6（H-2b）为供体、BALB/c（H-2d）为受体，或C57BL/6为供体，CB6F1（C57BL/6雄鼠与BALB/c雌鼠杂交的雌性后代）为受体（H-2d）。其中BALB/c作为受体时，称为完全异基因移植，CB6F1作为受体时，称为半相合基因移植。供体选择雄性、受体选择雌性小鼠，年龄多使用8±2周龄^[3]。
ABX小鼠构建：由于受体动物制备cGvHD模型前，需经过辐照破坏自身原有免疫系统，这会使得受体变得非常脆弱，故通常给受体小鼠进行肠道微生物清扫处理，形成抗生素清扫鼠（ABX鼠），一般使用万古霉素、青霉素、甲硝唑、新霉素、红霉素、庆大霉素、链霉素等抗生素进行组合。在小鼠接收辐照前后若干天时间，在小鼠的饮用水中加入含有一定剂量的上述抗生素物质饲喂小鼠（亦可使用灌胃+饮水方法），可形成ABX小鼠。
动物辐照：根据受体鼠种类的不同，选择合适的辐照方式及剂量。注意：市售辐照仪的射线源品种有所不同，如钴60、X射线、γ射线等，不同射线由于散射程度、穿透能力等原因，会造成同剂量不同射线辐照效果有所区别，但一般不会过于明显。建议与ABX剂量一起进行预实验条件摸索。
供体鼠PBMC悬液制备及受体回输：处死供体鼠，摘取脾脏、长骨骨髓制备为单细胞悬液后，尾静脉注射的方式回输到已经接受动物辐照的受体鼠体内。其中，回输的细胞悬液的细胞浓度在5×10^6cells/ml-1×10^7cells/ml不等（有可能会更多，较少使用更少的剂量）。脾单细胞和骨髓单细胞可选分别注射、混合后一同注射、只选择1种进行提取制备并注射。最终可引起cGvHD模型病变程度的不同。

1. 人源化小鼠模型

GvHD模型在临床上常见于同种异基因的个体间的移植，为了更贴合临床研究，常使用人外周血单个核淋巴细胞（human peripheral blood mononuclear cells (hPBMCs)），代替小鼠的脾脏、骨髓单细胞悬液，用以回输到受体小鼠体内。hPBMC需要先通过MACS进行磁珠分选（或无菌FACS流式分选），去除B细胞成分后再回输到小鼠体内（部分研究不予去除B细胞成分）。小鼠同样要接受辐照破坏免疫系统，之后接受新鲜hPBMC悬液的回输^[4]。

1. 造模鉴定方法

    对于cGvHD，2005年美国国立卫生研究院(NIH)共识会议建立了一套临床上的评分标准，该标准从器官层面出发，综合评估了皮肤、头发、指/趾甲、肝、肺、消化道、生殖器官等器官/系统的症状程度，以鉴定cGvHD综合病情^[5]。2014年国家卫生研究院的共识以新的证据为基础,以进一步的完善为基础,维持了先前共识的框架，其在2005年颁布的版本上又进行了若干调整^[6]。2014年共识标准明确了慢性GVHD的重叠亚类别，并建议记录慢性GVHD患者的所有临床特征，这些特征与预后、治疗指导、反应评估、生物标志物研究和临床试验相关。
进行小鼠实验也有相应的cGvHD临床评分及组织病理学评分^{[7, 8]}。

【参考文献】
[1] Zeiser R.,B. R. Blazar. Acute Graft-versus-Host Disease - Biologic Process, Prevention, and Therapy. N Engl J Med, 2017, 377(22):2167-2179.
[2] Zeiser R.,B. R. Blazar. Pathophysiology of Chronic Graft-versus-Host Disease and Therapeutic Targets. N Engl J Med, 2017, 377(26):2565-2579.
[3] 王三斌, et al. 小鼠同种异体骨髓移植GVHD模型的建立.实验动物科学与管理, 2006, 23(2):10-13.
[4] Wu X., et al. IL-21 accelerates xenogeneic graft-versus-host disease correlated with increased B-cell proliferation. Protein Cell, 2013, 4(11):863-71.
[5] Filipovich A. H., et al. National Institutes of Health consensus development project on criteria for clinical trials in chronic graft-versus-host disease: I. Diagnosis and staging working group report. Biol Blood Marrow Transplant, 2005, 11(12):945-56.
[6] Jagasia M. H., et al. National Institutes of Health Consensus Development Project on Criteria for Clinical Trials in Chronic Graft-versus-Host Disease: I. The 2014 Diagnosis and Staging Working Group report. Biol Blood Marrow Transplant, 2015, 21(3):389-401 e1.
[7] 黄欣, et al. miHA不合异基因骨髓移植后慢性移植物抗宿主病小鼠模型的建立.国际输血及血液学杂志 2014, 37(2):97-101.
[8] 吴远彬, et al. 单倍体供者淋巴细胞输注诱导慢性移植物抗宿主病小鼠模型的建立.中华器官移植杂志, 2017, 38(12):729-733.