一文读懂慢病毒与质粒,来学!

栏目:行业资讯 发布时间:2022-10-28
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慢病毒包装系统包括:2个包装质粒以及1个转移质粒,将这些质粒共转染包装细胞。2个包装质粒分别为:Gag/Pol表达质粒和Rev表达质粒。


慢病毒(Lentivirus)是逆转录病毒的一种,它能够将靶基因导入到一些较难转染的细胞,如原代细胞等,并且将靶基因随机整合到宿主的基因组中,从而大大增加了转染效率,并且能够在细胞系中稳定表达若干代,可以进行稳转细胞株的筛选。

 

慢病毒表达载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。

一、什么叫质粒

 

质粒(Plasmid)是附加到细胞中的非细胞的染色体或核区DNA原有的能够自主复制的较小的DNA分子;一般来说,质粒的存在与否对宿主细胞生存没有决定性的作用;它是基因工程最常见的运载体。

 

根据它们所带有的基因和赋于宿主细胞的特点分为六种不同的类型:

 

种类

功能

抗性质粒

可使宿主菌对某些抗菌素产生抗性

致育因子

可以通过接合在供体和受体间传递遗传物质

Col质粒

带有编码大肠杆菌素的基因

降解质粒

编码一种特殊蛋白,可使宿主菌代谢特殊的分子

侵入性质粒

使得宿主菌具有致病的能力

隐秘质粒

不显示任何表现类型,主要通过物理方法才能发现

二、什么叫慢病毒载体

 慢病毒载体,指以人类免疫缺陷病毒-1 (H IV-1) 来源的一种病毒基因治疗载体。区别一般的逆转录病毒载体,它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。慢病毒载体直接用于宿主细胞的感染,目的基因进入到宿主细胞之后,经过反转录,整合到基因组,从而高水平地表达效应分子。

 

 

三、质粒的构建

 

 

四、慢病毒载体构建及包装流程

 

慢病毒包装系统包括:2个包装质粒以及1个转移质粒,将这些质粒共转染包装细胞。2个包装质粒分别为:Gag/Pol表达质粒和Rev表达质粒。

 

 

 

1、慢病毒过表达质粒载体的构建

设计上下游特异性扩增引物,同时引入酶切位点,PCR从模板(CDNA质粒或者文库)中调取目的基因CDS区,连入T载体;将CDS区从T载体上切下,装入慢病毒过表达质粒载体。

 

2、慢病毒干扰质粒载体的构建

合成siRNA对应的DNA颈环结构,退火后连入慢病毒干扰质粒载体

 

3、慢病毒载体的包装与浓缩纯化

制备慢病毒穿梭质粒及其辅助包装原件载体质粒,4种质粒载体分别进行高纯度无内毒素抽提,共转染293T细胞,转染后18h 更换为完全培养基,换液30h后,收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液,病毒上清液通过超离心浓缩病毒。

五、质粒、慢病毒的应用

 

质粒的应用:

1、应用于基因治疗,如质粒DNA基因治疗药物(以质粒DNA为载体的基因治疗产品);2、外源基因的表达;3、基因工程:微生物基因工程;②植物基因工程;③动物基因工程。

 

慢病毒的应用:

1、获得性免疫缺陷综合征(AIDS)的基因治疗;2、神经系统疾病的基因治疗;3、血液系统疾病的基因治疗;
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