流式细胞术在以细胞凋亡为策略筛选抗肿瘤药物中的应用
全球肿瘤发病率持续上升，肿瘤方面的疾病已经成为影响人类健康的主要杀手之一。寻找合适的抗肿瘤药物已经成为人类对抗肿瘤的一种主要方法。
抗肿瘤药物筛选策略
抗肿瘤药物的筛选方法有多种，如细胞凋亡策略、诱导细胞分化、抑制血管生成等。以细胞凋亡为策略筛选肿瘤药物是众多方法中的一个主要方向。策略进行抗肿瘤药物筛选原理、分类
细胞凋亡也称细胞程序性死亡，是细胞受基因调控的一种主动性的、高度有序的自我消亡的过程。当某些因素破坏或抑制了凋亡途径，使凋亡过程发生障碍，使本该凋亡的细胞继续生存和增殖，最终导致形成肿瘤。以细胞凋亡为策略筛选肿瘤药物就是期望用筛选出的药物通过重启肿瘤细胞凋亡通路，使肿瘤细胞发生凋亡，从而达到治疗肿瘤疾病的目的。
以细胞凋亡为策略进行抗肿瘤药物筛选又可以分为动物水平（体内）和细胞水平（体外）。在动物水平又分为CDX模型（肿瘤细胞系移植）、PDX模型（肿瘤组织移植）等，通过给药后进行药效评价来筛选出合适的药物。毫无疑问，动物水平的药物筛选是必须要做的。然而动物水平实验要花费的经费、周期以及精力都是巨大的，不通过体外实验就直接进行体内实验是具有相当大的风险的。体外实验周期短、见效快、花费低、风险也更低，不仅能为体内实验做前期探索，并且体外实验还能研究药物发生作用的分子机理。无疑，在体内实验进行前先做细胞水平（体外）实验是非常不错的研究策略。（PS:本公司也精于CDX、PDX模型哦！详情可点击小鼠成瘤肿瘤模型、相关经验-异种移植模型了解。）
三、流式细胞术在以细胞凋亡为策略筛选抗肿瘤药物中的应用
以细胞凋亡为策略的细胞水平上药物筛选方法包括：细胞增殖检测、细胞凋亡检测等，并且几种方法常联用。细胞增殖检测方法常用MTT或CCK8进行，具体实验方法可参见本公司另一篇公众号《细胞毒性之CCK8实验》。这里主要介绍细胞凋亡检测，以及流式细胞术在细胞凋亡检测中的应用（流式细胞术相关知识请点击流式细胞术—相见恨晚了解）。
凋亡细胞在形态学和生化上有明显的特征，如细胞皱缩、核固缩、细胞膜卷曲、DNA片段化、线粒体电位发生变化等。因此根据这些特征，流式细胞术有多种方法能定性及定量的检测细胞凋亡情况。如Annexin V和PI双染法、TUNEL法检测细胞凋亡、线粒体膜电位法等等。
四、重点介绍Annexin V和PI双染法检测细胞凋亡
其原理是：正常细胞膜是不对称性的，胞浆面含有带负电的磷脂(如磷脂酰丝氨酸, PS)。早期凋亡时，细胞表面不对称性发生改变，PS外翻到胞外侧。
Annexin V是一种Ca2+依赖性的对PS有高度亲和力的磷脂结合蛋白，可作为探针识别膜表面是否有PS，从而识别凋亡细胞。
PI常用于鉴别死细胞。凋亡细胞的细胞膜仍然是完整的，所以PI不能进入早期凋亡细胞核内。Annexin V和PI双染法无疑是在细胞水平检测凋亡的最优先的选择。
用待筛选的药物及溶剂对照分别处理目的细胞一段时间，如24h、48h或72h，再用Annexin V和PI双染法检测细胞凋亡。这个实验所需试剂皆已商品化，具体操作流程可按照试剂说明进行。但需要注意的地方有三点：一是需要确定待测药物所能起最佳作用的细胞。一种药物不一定对所有类型的肿瘤都有作用，即便有作用，对不同肿瘤作用的大小也不一样。因此找到最适合待测药物起作用的肿瘤以及该肿瘤所对应的细胞系是非常关键的。常用的方法包括查阅资料、生物信息学（或网络药理学）方法、大范围筛选（分别用待测药物检测数种细胞系）等。二是待测药物作用的时间（不能太短，亦不能太长）。三是药物的剂量（浓度不能太低，亦不能太高）。并且以上三点亦可以作为体内实验的前期探索。
图1：某浓度药物处理某细胞X小时后流式检测细胞凋亡
当流式检测完成后用流式分析软件，以全阴性和Annexin V单染、PI单染为对照画门，从而得出如图1类型的图。从图中可看出，与溶剂组相比，当用药物处理细胞后，早期凋亡（右下象限）和晚期凋亡（右上象限）细胞占比增加。说明此药物能够诱导该细胞凋亡。当然，是否是最佳剂量及时间还需要做梯度实验。
Annexin V和PI双染后流式检测细胞凋亡的方法已广泛用于抗肿瘤药物研究。Namrata Karki等此方法检测了不同浓度的胡桃醌（Juglone）对MIA-PACA-2细胞（人胰腺癌细胞）凋亡的影响（图2，Namrata Karkia et al. Cytotoxicity of juglone and thymoquinone against pancreatic Cancer cells. Chem Biol Interact. 2020 August 25; 327: 109142）。发现随着胡桃醌浓度增加，MIA-PACA-2细胞总凋亡率也在增加，尤其是晚凋细胞增加最为明显。
图2：胡桃醌诱导MIA-PACA-2细胞凋亡
Qinwan Huang等用此方法研究了羌活醇（Notopterol）对HL-60细胞（人急性髓细胞白血病细胞）的影响（图3，Qinwan Huang et al. Notopterol-induced apoptosis and differentiation in human acute myeloid leukemia HL-60 cells,Drug Design. Development and Therapy 2019:13 1927–1940）。发现羌活醇能够促进HL-60细胞凋亡，并具有剂量依赖性。
图3：羌活醇诱导HL-60细胞凋亡
Chenglu Zhu等用Annexin V和PI双染法发现天花粉蛋白(trichosanthin, TCS)能诱导Hela细胞（人宫颈癌细胞）和Caski细胞（人宫颈癌细胞）凋亡，尤其是早期凋亡增加最为明显（图4，Chenglu Zhu et al. Trichosanthin inhibits cervical cancer by regulating oxidative stress-induced apoptosis. BIOENGINEERED. 2021, VOL. 12, NO. 1, 2779–2790）。
图4：天花粉蛋白诱导Hela和Caski细胞凋亡
此外，TUNEL法和线粒体膜电位法亦常用于检测细胞凋亡。因为细胞也会有荧光发生，故可用荧光显微镜和流式细胞仪来检测，更多详情请咨询拓普生物！
